一、方案制作

1.1 基因信息

Rhot2为小鼠（Mus musculus）的ras homolog family member T2基因，NCBI数据库内cDNA号为NM_145999.2，该基因的蛋白编码区（cds）位于416..2278。

1.2 Targeting Strategy

乙方运用专业技术知识、经验，根据甲方的具体要求设计myc-Rhot2基因（图1），并将线性DNA显微注射到小鼠受精卵内，最后产生myc-Rhot2转基因小鼠。

图1

1.3 Myc-Rhot2序列信息

红色表示Myc标签，蓝色表示Rhot2蛋白编码（cds）区

1.4 技术路线：

针对 Rhot2基因，设计并构建CMV启动的N段带有Myc标签的Rhot2表达质粒；线性化DNA；受精卵注射，移植。注射用的受精卵为C57BL/6N背景；通过PCR和测序对出生的小鼠进行基因鉴定，得到3只以上的F0代转基因小鼠（图2）。

图2. 原核显微注射法生产转基因动物

二、技术流程

2.1 cDNA的获得

提取C57小鼠大脑组织RNA (Trizol, Life,15596-018)，反转录cDNA (RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit, Fermentas, K1622)。

2.2 PCR 扩增Myc-Rhot2 cds片段

2.2.1引物信息

Rhot2-clone-F：tttggcaaagaatttctcgagatgGAGCAGAAACTCATCTCTGAAGAGGATCTGatgcggcgcgatgttcgcat

Rhot2-clone-R：Ctgcacctgaggagtgaattcctcgagtcatcggctcttcactagga

2.2.2 PCR扩增

PCR酶：Q5^®Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase, M0493L, NEB.

退火温度：58 ℃。

产物长度：1945 bp

2.3 CMV-myc-Rhot2表达载体构建

（1）产物片段连接：ClonExpress^TM II  One Step Cloning Kit，C112-01 Vazyme Biotech。

（2）CMV-myc-Rhot2载体图示（图3）：

图3. CMV-myc-Rhot2载体图示

（3）CMV-myc-Rhot2载体序列：

（4）myc-Rhot2载体测序结果（详见附件1）：

2.4 显微注射法生产转基因小鼠

sspI, AvrII双酶切线性化DNA，切胶回收CMV-myoc-Rhot2目的片段。C57BL/6N受精卵显微注射DNA后，通过胚胎移植生产转基因小鼠。鼠尾DNA提取后，PCR及产物测序后鉴定CMV-myoc-Rhot2转基因阳性鼠。

三、基因型鉴定报告

3.1引物信息：

Pimer1 (P1)

Rhot2-genotype-F1: GAGCAGAAACTCATCTCTGAAG

Rhot2-genotype-R1: CGCAGGTCAGACTTATTGCC

退火温度：65℃

产物长度：398bp

PCR鉴定策略（图4）：

图4

转基因阳性鼠尾DNA PCR产物测序报告（详见附件2）：

Pimer2 (P2)

Rhot2-genotype-F2: GAGCAGAAACTCATCTCTGAAG

Rhot2-genotype-R2: CGCAGGTCAGACTTATTGCC

退火温度：60℃

产物长度：541bp

PCR鉴定策略（图5）：

图5

转基因阳性鼠尾DNA PCR产物测序报告（详见附件3）：

 Pimer3 (P3)

Rhot2-genotype-F3: CAGGAAGGAAATGGGCGGG

Rhot2-genotype-R3: CACAGCCTCCATGGTACTCC

退火温度：60℃

产物长度：685bp

PCR鉴定策略（图6）：

图6

转基因阳性鼠尾DNA PCR产物测序报告（详见附件4）：

3.2 PCR反应体系

3.3 PCR反应条件

3.4 电泳图

Primer1：

图7：M：DNA Marker （自下而上：100bp, 200bp, 500bp, 750bp,1000bp,2000bp）1-7：鼠尾DNA。WT：野生型鼠尾DNA。H2O：PCR反应体系中不添加DNA。★：转基因阳性鼠。↓：PCR目的条带。

图8：M：DNA Marker （自下而上：100bp, 200bp, 500bp, 750bp,1000bp,2000bp）。1-3：鼠尾DNA。WT：野生型鼠尾DNA。Vector：PCR反应体系中添加阳性质粒。H2O： PCR反应体系中不添加DNA。★：转基因阳性鼠。↓：PCR目的条带。

Primer2：

图9：M：DNA Marker （自下而上：100bp, 200bp, 500bp, 750bp,1000bp,2000bp）1-7：鼠尾DNA。WT：野生型鼠尾DNA。H2O：PCR反应体系中不添加DNA。★：转基因阳性鼠。↓：PCR目的条带。

Primer3：

图10.M：DNA Marker （自下而上：100bp, 200bp, 500bp, 750bp,1000bp,2000bp）1-3：鼠尾DNA。WT：野生型鼠尾DNA。Vector：PCR反应体系中添加阳性质粒。H2O： PCR反应体系中不添加DNA。★：转基因阳性鼠。↓：PCR目的条带。

 四、分析与结论

通过PCR及其产物测序的方法鉴定小鼠基因型，本项目共产生4只CMV-myoc-Rhot2转基因阳性鼠。