一、客户实验要求和内容

物种：小鼠

品系：C57BL/6J

基因名称：Hspa5

实验目的：CRISPR技术制备Hspa5基因组织特异性基因敲除小鼠(Loxp)。

基因信息：

Description：heat shock protein 5

Synonyms： 78kDa, Bip, D2Wsu141e, D2Wsu17e, Grp78, Hsce70, Sez7, XAP-1 antigen, baffled, mBiP

Location：Chromosome 2: 34,771,970-34,777,547 forward strand. 

Gene ID: 14828. 

二、 制作方案

1.技术原理：

利用CRISPR技术剪切目标基因Hspa5的内含子区，小鼠受精卵细胞通过HDR的DNA修复,在5’端和3’端内含子区插入loxp序列DNA，从而实现Hspa5基因组织特异性敲除的目的。

采用最新的spCas9.1进行剪切基因组DNA，减少了off-Target。

2.实验设计

(1)根据Hspa5的基因组序列结构，设计CRISPR靶点：

根据目前基因组数据，Hspa5基因存在2个蛋白转录产物（Hspa5-201, Hspa5-202），Hspa5-201和 Hspa5-202 的exon 3 protein coding区无任何差异，长度为232bp（3个非整数倍）(图1)。

根据目标基因Hspa5的基因组结构，参考文献中的敲除方案，选择exon3 5’端内含子与3’端内含子区各设计一个gRNA, Donor DNA通过HDR途径在内含子区插入Loxp序列DNA（ataacttcgtataatgtatgctatacgaagttat）。同时，插入单一内切酶序列DNA(EcoRI或EcoRV)利于PCR-RELP实验鉴定阳性小鼠基因型。因此，CRISPR设计靶点将设计在转录产物Hspa5的exon3 5’端3’端内含子区 (图2)（下图中的箭头所指位置）；

高效sgRNA序列：

exon3 5’ intron sgRNA-L: GGGGCCAGCGTGAGAAAGTG；

3’ intron sgRNA-R: TGTGTTCGGAATTTATGTAA.

(2)技术路线：

体外转录sgRNAs；受精卵注射，移植。通过PCR-RELP实验和测序对出生的F0小鼠进行基因鉴定，阳性小鼠与野生型小鼠交配，得到F1代Hspa5基因组织特异性敲除小鼠 (Loxp)。

三、Hspa5基因组织特异性敲除小鼠(Loxp)的构建

2个体外转录sgRNAs，一个Donor DNA与spCas9蛋白一起注射到小鼠体外受精卵中，出生30只仔鼠。两周龄后，对出生的小鼠进行PCR-RELP和测序，对其进行基因型分析和鉴定（是否在内含子区插入loxp序列DNA），获得发生期望首建小鼠。将F0代阳性小鼠与wt小鼠交配，产生F1代小鼠，基因型鉴定出阳性小鼠。 

① exon3 5’ 内含子PCR-RELP

（1）设计基因型检测PCR引物如下：

Hspa5-L-F: GAACCGTCGTCGCGTTTCG;

Hspa5-L-R: CCAAGTGCGTCCGATGAGG.

positive length: 553 bp

（2）鼠尾DNA PCR反应体系

（3）PCR反应条件

（4）酶切反应条件

（5）电泳图

（6）测序报告（附件L）

测序引物Hspa5-L-F: GAACCGTCGTCGCGTTTCG

(7)单克隆测序报告（附件L）

② exon3 3’ 内含子PCR-RELP

（1）设计基因型检测PCR引物如下：

Hspa5-R-F: GCCAAGAACCAACTCACGTC;

Hspa5-R-R: AATGTCTTGGTTTGCCCACCT.

positive length: 601 bp

（2）鼠尾DNA PCR反应体系

（3）PCR反应条件

（4）酶切反应条件

（5）电泳图

（6）测序报告（附件R）

测序引物Hspa5-R-sequence: GGGAAATCACAACTAAAACTG

(7)单克隆测序报告（附件R）

③ exon3 外显子

（1）设计基因型检测PCR引物如下：

Hspa5-loxp_geno-F: Ggaattcataacttcgtataatgtatgc;

Hspa5-loxp_geno-R: atacattatacgaagttatgatatcAC.

positive length: 460 bp，备注此引物可以鉴定5’端 3’端loxp是否在同一条染色体上。

（2）鼠尾DNA PCR反应体系

（3）PCR反应条件（touch down）

（4）电泳图

（5）测序报告（附件exon3）

sanger测序结果显示：F1代阳性小鼠的Hspa5 exon3序列完整（正反向双向测序），详情附件中。

④ 野生型小鼠鉴定策略

（1）设计基因型检测PCR引物如下：

Hspa5-wt_geno-F: CCAGCGTGAGAAAGTGAGGT;

Hspa5-wt_geno-R: TCCGAACACATTCTTTTAAGTCCT.

wt length: 400 bp，备注此引物可以鉴定loxp区域为wt型染色体。

（2）鼠尾DNA PCR反应体系

（3）PCR反应条件

（4）电泳图

（5）测序报告（附件wt primer）

sanger测序结果显示：PCR产物正确，详情附件中。

四、结论

F1代 1# (♂)，2# (♂)，3# (♀)，5# (♀)，6# (♂)小鼠为Hspa5基因组织特异性敲除小鼠(Loxp)的阳性杂合子，小鼠在Hspa5 exon3 5’端 3’端正确插入Loxp序列DNA，并保证exon3序列地完整。建议：在扩繁基因型鉴定时， Hspa5-loxp_geno-F和Hspa5-loxp_geno-R引物鉴定Loxp阳性染色体，Hspa5-wt_geno-F和 Hspa5-wt_geno-R引物鉴定野生型染色体。